酵母，如釀酒酵母、裂殖酵母和畢赤酵母，通常用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。酵母是易于培養(yǎng)的單細(xì)胞真核生物，他們的基因和蛋白質(zhì)與哺乳動(dòng)物具有很好的相似性，所以是生物模型。
酵母細(xì)胞用于研究基因功能，蛋白質(zhì)相互作用，細(xì)胞通路等，也是大規(guī)模異源蛋白表達(dá)和小分子生產(chǎn)的宿主，在發(fā)酵，釀造和制藥行業(yè)等起著*的作用。涉及酵母的常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)有酵母雙/三雜交系統(tǒng)，突變體篩選庫(kù)和同源重組，等等。
為什么我們需要酵母感受態(tài)細(xì)胞?
通常，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需外源DNA引入到酵母細(xì)胞。引入基因片段(線性ssDNA或質(zhì)粒)是通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化來(lái)實(shí)現(xiàn)的，具體方法有化學(xué)法，如醋酸鋰和聚乙二醇(PEG)或電穿孔法。
有效的酵母轉(zhuǎn)化需要高質(zhì)量的酵母感受態(tài)細(xì)胞為開始。勝任力則是指細(xì)胞能吸收游離的細(xì)胞外的遺傳物質(zhì)(如質(zhì)粒DNA)的能力。
二、酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
獲得感受態(tài)細(xì)胞相當(dāng)簡(jiǎn)單，但許多研究人員在實(shí)現(xiàn)良好的生存比例和轉(zhuǎn)換效率時(shí) 遇到問(wèn)題。常見(jiàn)的誤區(qū)包括由于制備條件惡劣導(dǎo)致高的細(xì)胞死亡率，或由于無(wú)效的感受態(tài)細(xì)胞制備導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率低。
雖然酵母細(xì)胞和大腸桿菌一樣容易生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化，但它們需要不同的處理方法來(lái)制備感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化。酵母細(xì)胞像哺乳動(dòng)物細(xì)胞一樣，有類似的處理程序。典型的酵母感受態(tài)細(xì)胞制備協(xié)議如下:
過(guò)夜培養(yǎng)你想轉(zhuǎn)化的酵母菌菌株，使用營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基培養(yǎng)不含質(zhì)粒的細(xì)胞。對(duì)于已經(jīng)含有質(zhì)粒的細(xì)胞，使用適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基來(lái)維持質(zhì)粒。
當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1 - 2 x 107cells/mL，離心收獲細(xì)胞。細(xì)胞密度可以通過(guò)使用分光光度計(jì)在OD600檢測(cè)，或者使用血球計(jì)在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。
沖洗細(xì)胞，重懸于無(wú)菌水，離心，棄上清，重復(fù)此步驟兩次以*清洗細(xì)胞。
一次洗完，將細(xì)胞重懸于感受態(tài)細(xì)胞溶液，分裝，大約每管108個(gè)細(xì)胞，每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)將使用這些數(shù)量的細(xì)胞。分裝好的管子放于-80°C，供以后實(shí)驗(yàn)使用。
在所有步驟中，使用質(zhì)量好的無(wú)菌過(guò)濾器消毒過(guò)的試劑，以防止污染問(wèn)題。
感受態(tài)細(xì)胞溶液包含濃度的冷凍保護(hù)劑，這些濃度應(yīng)該在你的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)使用的酵母菌株和細(xì)胞的濃度。標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議使用5%的甘油 + 10% DMSO溶液混合，這種配方被廣泛應(yīng)用來(lái)制備感受它細(xì)胞，也可根據(jù)具體情況進(jìn)行輕微的改變或調(diào)整。